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【摘要】 本發(fā)明涉及一種木霉菌轉(zhuǎn)化子的限制性內(nèi)切酶 介導(dǎo)基因整合化構(gòu)建方法，首先通過產(chǎn)孢、菌絲培養(yǎng)以及采用 崩潰酶酶液和山梨糖醇緩沖液處理，得到木霉菌菌株原生質(zhì) 體，然后將提取質(zhì)粒DNA與制備的木霉菌原生質(zhì)體混合，在 限制性內(nèi)切酶的作用下，使外源線性質(zhì)粒片段插入染色體組誘 導(dǎo)插入突變，最后對突變的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，得到比親本生防 效果更好的優(yōu)良生物防治木霉菌突變株。本發(fā)明利用限制性內(nèi) 切酶介導(dǎo)的基因整合化技術(shù)可以得到大量的木霉菌轉(zhuǎn)化子，并 可從中篩選到對番茄灰霉病和黃瓜枯萎病等防治效果顯著高 于野生菌株的轉(zhuǎn)化子，為擴(kuò)大菌種資源，克隆生物防治基因資 源，獲得多功能生物防治菌株奠定基礎(chǔ)。 【專利類型】發(fā)明申請 【申請人】上海交通大學(xué) 【申請人類型】學(xué)校 【申請人地址】200240上海市閔行區(qū)東川路800號 【申請人地區(qū)】中國 【申請人城市】上海市 【申請人區(qū)縣】閔行區(qū) 【申請?zhí)枴緾N200610030904.4 【申請日】2006-09-07 【申請年份】2006 【公開公告號】CN1916177A 【公開公告日】2007-02-21 【公開公告年份】2007 【IPC分類號】C12N15/80; C12N1/14; C12N1/15; C12R1/885 【發(fā)明人】陳捷; 劉限; 黃玉茜; 管麗萍 【主權(quán)項(xiàng)內(nèi)容】1、一種木霉菌轉(zhuǎn)化子的限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)基因整合化構(gòu)建方法，其特征在于 包括如下具體步驟： (1)木霉菌菌株原生質(zhì)體的制備：首先將木霉菌在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢后， 用無菌水洗下木霉菌孢子，然后將木霉菌孢子加入PDB液體培養(yǎng)基中，在25-30℃ 下，100-150轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)18-22小時，過濾收集菌絲，再用0.7摩爾/升NaCl溶 液沖洗菌絲；將崩潰酶用0.7摩爾/升NaCl溶液配制濃度為13-20毫克/毫升的酶 液，將上述得到的菌絲放入離心管，再將配制好的崩潰酶酶液以菌絲2倍體積的量 加到離心管中，在25-30℃下以120-150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3-4小時，然后過濾，并 用0.7摩爾/升NaCl溶液沖洗菌絲，收集原生質(zhì)體于離心管中，將離心管得到的原 生質(zhì)體溶液離心、去上清；然后重復(fù)向離心管中加入山梨糖醇緩沖液沖洗原生質(zhì)體 沉淀、離心、去上清2-3次；再根據(jù)得到的原生質(zhì)體的量向離心管中加入山梨糖 醇緩沖液，調(diào)節(jié)原生質(zhì)體濃度至107-108個/毫升；其中，所述山梨糖醇緩沖液的組 分為：山梨醇316.256克、PH7.5的1摩爾/升Tris-Hcl？10毫升、CaCl2？1.11g，加水 定容到1000ml； (2)質(zhì)粒提取與DNA消化：吸取含有質(zhì)粒PV2的冷凍保存的菌種100微升，加到 含有50微克/毫升的氨芐青霉素的100毫升的LB液體培養(yǎng)基上，37℃140-200轉(zhuǎn)/ 分搖床培養(yǎng)12-16小時，取已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的1.5毫升細(xì)菌培養(yǎng)液放于1.5毫 升的離心管中，5000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清，向留有沉淀的離心管中加入100 微升含有50毫摩爾/升葡萄糖，10毫摩爾/升乙二胺四乙酸，25毫摩爾/升Tris-HCl的溶液I進(jìn)行懸浮沉淀，冰浴5-10分鐘，再加入200微升含200毫摩爾/升NaOH， 1％SDS的溶液II，置冰浴5分鐘使質(zhì)粒DNA變性后，再加入150微升含3摩爾/升 醋酸鉀，pH4.8的溶液III，混勻，冰浴5-10分鐘；向離心管中加入450微升的按 體積25∶24∶1配比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進(jìn)行抽提，10000轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘；吸取上清于另一離心管中，向其中加入與上清等體積的按體積25∶24∶1配 比的酚∶氯仿∶異戊醇的混合物進(jìn)行抽提，重復(fù)此抽提步驟2-3次；最后吸取上清 于另一離心管中，向管中加入上清液的2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻， -20℃放置30分鐘，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，倒掉上清，向管中沉淀加入30-50 微升10毫摩爾/升Tris.Hcl，1毫摩爾/升乙二胺四乙酸配置的緩沖液，得到含有 RNA的DNA溶液；向此溶液中加入無DNA的RNase？A，使其終濃度達(dá)10-20微克/毫 升，37℃溫育30-60分鐘，去除RNA得到質(zhì)粒DNA；其中，所述LB培養(yǎng)基的組分為： 10克胰化蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl，溶于950毫升去離子水中，調(diào)節(jié)pH 值到7.0，每瓶100毫升分裝滅菌后備用； (3)轉(zhuǎn)化：在50毫升離心管中加入質(zhì)粒40微克、濃度為10個單位/微升限 制性內(nèi)切酶HindIII10微升、山梨醇緩沖液200微升，配制成酶-質(zhì)?；旌弦?，然后 向離心管中加入100-200微升原生質(zhì)體懸浮液，并使其與酶-質(zhì)?；旌弦夯靹?，置 冰上15-20分鐘，緩慢向管中加入2毫升聚乙二醇，冰浴20-25分鐘，然后將離心 管取出在28℃下放置10-20分鐘，加入5毫升預(yù)冷的山梨醇緩沖液，4℃下2000轉(zhuǎn) /分離心15分鐘，棄上清，加入3毫升液體再生培養(yǎng)基，25-30℃下放置6小時；然 后將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，加入15毫升預(yù)先熔化并冷卻至50℃的固體再生培養(yǎng)基， 混勻后冷卻干燥，熔化水瓊脂，并冷卻至50℃，加入潮霉素至濃度為300微克/毫 升，快速倒入平板中，在28-30℃下，培養(yǎng)4-5天，將能夠抗潮霉素的菌落轉(zhuǎn)移到 預(yù)先倒好的含有潮霉素250微克/毫升的固體PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選，能夠繼續(xù) 生長的菌落為得到的木霉菌轉(zhuǎn)化體；其中，所述液體再生培養(yǎng)基的組分為： (NH4)2SO4？2.8克、尿素600毫克、磷酸鉀4克、葡萄糖40克、蔗糖100克、CaCL2？600 毫克、MgSO4.10H2O？200毫克、FeSO4.7H2O？10毫克、ZnSO4.7H2O？1.8毫克、 MnSO4.H2O？3.2毫克、CoCL2.6H2O？4毫克；所述固體再生培養(yǎng)基的組分是在液體再 生培養(yǎng)基組分的基礎(chǔ)上，再加入瓊脂17-20克。 來源：百度馬 克 數(shù)據(jù)網(wǎng) 【當(dāng)前權(quán)利人】上海交通大學(xué) 【當(dāng)前專利權(quán)人地址】上海市閔行區(qū)東川路800號 【統(tǒng)一社會信用代碼】1210000042500615X0

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